USO Y APLICACIÓN DE LOS EQUIPOS PARA PROTECCION DEL OPERADOR Y DEL AMBIENTE

En los laboratorios de investigación bacteriológica y de virología, se efectúan trabajos con materiales peligroso para la salud, como cultivos de patógenos, virus, productos biológicos desconocidos en cultivo de tejidos, materiales cancerígenos, etc.
En producción farmacéutica se trabaja con productos oncológicos, hipnóticos, etc. que demandan la protección del operador y del ambiente.
Para lo anterior se utilizan diferentes equipos de seguridad biológica definidos según sean para la protección del operador y del ambiente de laboratorio solamente, o también para preservar al producto o cultivo del contaminante ambiental, manteniéndose entonces un doble compromiso. Hay que considerar el hecho de que en un 30% de los casos las causas de las infecciones adquiridas son desconocidas en cuanto al medio de transmisión.
Las infecciones por causas conocidas son en su mayoría originadas por accidentes que son consecuencia de alguna forma de contacto directo, como inoculación o ingestión. Más difíciles de reconocer son las causas originadas por aerosoles patógenos generado por pipeteo, transvasado, centrifugación y manipulación de cultivos.
El reconocimiento del peligro de las enfermedades e infecciones adquiridas en el laboratorio ha llevado a la necesidad de desarrollar métodos, procedimientos y equipos para llevar a un mínimo la exposición del operador o agentes infecciosos conocidos o potencialmente peligrosos.
Con el desarrollo de la ingeniería genética y los laboratorios de bioingeniería y ADN recombinantes, la necesidad de equipos confiables de bioseguridad se ha incrementado al máximo en especial en laboratorios donde se trabaja con agentes exóticos. La necesidad de aislación de los mismos con el ambiente exterior ha llevado al equipamiento de bioseguridad a cumplir con condiciones extremas.
Sin ir más lejos, en nuestro país la erradicación de la fiebre aftosa hace que los laboratorios donde se trabaja con dicho virus sean sometidos a exigencias máximas. En casos de precauciones extremas se instalan dos filtros HEPA en serie evitándose el riesgo potencial de pérdidas por accidente en uno de ellos.
Actualmente se fabrican filtros ULPA (Ultra Low Penetration) definidos con eficiencias del 99.999% y 99.9999% en 0,12 micrones. Se ha verificado que el aerosol de mayor penetración no es como se creía de 0,3 sino de 0,12 micrón, pero las diferencias de penetración no son substanciales, razón por la cual sigue utilizándose la vieja definición de filtro HEPA. La selección de equipos por sus clases I, II y III se hace en función de su riesgo, basándose en la monografía del NIH (Nacional Institute of Health) y del C.D.C. (Conter for disease control) en EEUU, con agentes de riesgos de Niveles 1,2,3 y 4 siendo el nivel 1 de mínimo riesgo y el 4 de máximo riesgo.
§ Nivel de riesgo 1: Agentes biológicos de los que no se conoce como causantes de enfermedades en adultos sanos. No se requiere generalmente equipos de seguridad biológica.
§ Nivel de riesgo 2: Agentes asociados con enfermedades humanas. Peligrosas por : Autoinoculación, ingestión, mucosas. Prácticas: Uso de equipos de seguridad biológica clase I o clase II.
§ Nivel de riesgo 3: Agentes biológicos locales o exóticos con posibilidad de contaminar por transmisión por aerosoles enfermedades que puede tener consecuencias graves.
§ Nivel de riesgo 4: Agentes extremadamente peligrosos y/o exóticos, que pueden transmitirse por aerosoles.
En la práctica se utilizan únicamente equipos de seguridad Clase III (cajas de guantes) con cuidados extremos con el personal, incluyendo a veces ropas con escafandras con presión positiva. Se requieres esterilización de todos los residuos por autoclave o incineración y cambios de ropas esterilizadas.

EL AMBIENTE DE LABORATORIO DE BIOSEGURIDAD

A diferencia de las áreas limpias utilizadas para llenado aséptico en la industria farmacéutica, que se encuentran en zonas con inyección de aire por filtro HEPA y presión positiva para evitar la posibilidad de entrada de contaminantes a la zona limpia, donde se trabaje con patógenos de deberá estar con presión negativa.
La idea fundamental es que en toda operación, sea de manipuleo, transvasado, agitación, centrifugación o pipeteo, habrá una generación de aerosoles (Figura 1).
Cuando se trate de patógenos, deberá evitarse la posibilidad de su salida al exterior por el riesgo que ello implica. Para ello el gabinete de seguridad biológica, que llamaremos de primera barrera, deberá ser instalado en ambientes de laboratorio que llamaremos de barrera secundaria. Dichos ambientes como habíamos mencionado previamente, amén de presentar superficies lisas en paredes y pisos (con zócalos redondeados) que faciliten su limpieza y desinfección, deberán tener una extracción de aire a través de filtros HEPA, tal que provoque un ambiente de presión negativa. Se evitará el escape al exterior de aerosoles en caso de algunas aperturas, accidentes o pérdidas (Figura 2).
La mayoría de los gabinetes de seguridad biológica fueron utilizados para aislar al experimento del investigador. Los equipos de aislación de áreas limitadas construidos fueron llamados Clase I, II y III por los laboratorios biológicos del ejército de los EEUU establecidos en Fort Detrick, los que hicieron la mayor parte del trabajo de desarrollo de los mismos.

EQUIPOS CLASE I

Los gabinetes de seguridad Clase I son básicamente campanas de extracción de acero inoxidable que usan un caudal de aire que se dirige del ambiente hacia la mesa de trabajo y de allí a un extractor con filtros HEPA, de manera de evitar la salida de aerosoles al ambiente del laboratorio.
La mayor desventaja del gabinete Clase I, es que los materiales en experimentación son expuestos a los contaminantes ambientales que entran al gabinete con el aire ambiente. Más aún, el hecho de que el régimen de desplazamiento del aire sea turbulento, hace posible la contaminación cruzada dentro del gabinete (Figura 3 y 4).
Los gabinetes Clase I son de seguridad parcial para trabajos con agentes de riesgos bajos o moderados, donde hay una necesidad de aislación para el ambiente y el operador pero no para el producto.
Permítasenos subrayar una vez más que el gabinete no aísla a los cultivos y materiales en experimentación de los contaminantes del aire ambiente del laboratorio.
La mayor diferencia entre los equipamientos Clase I y las campanas de extracción de humos se debe al filtro HEPA, que es el elemento fundamental para evitar el escape de aerosoles al ambiente. La protección del personal se hace posible por el movimiento constante de aire del operador hacia el gabinete.
Como se muestra en el esquema de la Figura 3, el flujo controlado de aire en el área de trabajo evita la salida de los contaminantes por la abertura frontal dando protección al personal. Siendo el flujo de aire inducido por un motoventilador centrífugo que extrae el aire del gabinete, se genera una presión negativa dentro del mismo, evitando la salida del aire contaminado hacia el ambiente exterior.
La Figura 5 muestra una cabina Clase I que a continuación del filtro HEPA tiene en la extracción un filtro de carbón activado para la eliminación de gases contaminantes que no son eliminados por el primero.

EQUIPOS CLASE II

Es de extrema importancia considerar dentro de los equipos de seguridad biológica los Clase II. En éstos se combinan dos necesidades o características: Se protege al producto del operador y del ambiente; y se protege al operador y al ambiente del producto.
El equipo Clase II es de flujo laminar vertical pero el porcentaje del aire se recircula dentro del gabinete extrayéndose el resto por un filtro HEPA. La cantidad de aire extraído es equivalente al caudal de aire de entrada en forma de cortina que aísla el ambiente del gabinete del ambiente exterior. Una de las diferencias fundamentales del equipo de seguridad biológica Clase II vs. los equipos comunes de flujo laminar, es que éstos (sean de flujo horizontal o vertical) no aíslan de ningún modo al ambiente de laboratorio de los aerosoles generados por el producto que los impulsa por la corriente de aire estéril. Si bien todos los equipos de seguridad biológica Clase II son de flujo laminar vertical, la inversa no es necesariamente cierta.
Hay equipos de flujo laminar vertical para protección del producto que no protegen ni al operador ni al ambiente como se muestra en la Figura 6.

GABINETES DE SEGURIDAD BIOLOGICA

TIPOS DE GABINETES

Desde el desarrollo de los primeros gabinetes Clase II, las modificaciones en los diseños ha llevado a la designación de varios tipos de los mismos. Esta clasificación ha originado una cierta confusión entre los usuarios, que trataremos de disipar en forma simple a continuación.
Es importante que el usuario que debe seleccionar un gabinete, y en la mayoría de los casos hacer la especificación que corresponde para su compra o licitación, sepa elegir el equipo más adecuado para su trabajo. De allí la importancia del conocimiento de las distintas alternativas.
Como ejemplo de la confusión, siendo los equipos de seguridad biológica Clase II de flujo vertical, en varias oportunidades se han hecho especificaciones en donde lo único que se menciona es "gabinetes de flujo laminar vertical", sin dar las características y especificaciones de los equipos Clase II que tienen normas reconocidas internacionalmente como las NIH 03/112 y la NSF 49.
Errores groseros, como el mencionado anteriormente, han resultado en la aplicación de gabinetes de flujo laminar común sin ninguna protección para el operador ni para el ambiente. En ese caso el flujo de aire se transforma en el vehículo de los aerosoles patógenos hacia el exterior del mismo.
La más práctica y entendible clasificación de los gabinetes Clase II es la que se describe en la tabla I.
Todos los equipos Clase II tienen en común la succión por una reja perforada que induce una cortina de aire, impidiendo la entrada o salida de aerosoles por la abertura frontal del equipo. La abertura frontal es de aproximadamente 20 cm. a lo largo de la mesa de trabajo (Figura 7).
Las grandes diferencias entre estos equipos consisten en el porcentaje de aire recirculado y el aire de extracción.
En casos de generación de gases y vapores que no son retenidos por el filtro HEPA será necesario que la recirculación del aire sea mínima o nula, porque de contrario aumentará la concentración gaseosa en la zona de trabajo. Por otro lado también es importante definir la salida del aire de extracción.
Cuando se generan vapores o gases es necesario que el filtro de extracción esté conectado al exterior del edificio por conductos, para no contaminar el ambiente del laboratorio.
Los equipos tipo A pueden estar conectados al exterior del edificio o tener la extracción al ambiente del laboratorio. En cambio, todos los equipos tipo B tienen extracción al exterior del edificio.

EXTRACCION vs. RECIRCULACION

Las mayores diferencias entre el tipo A, el tipo B y los gabinetes 100% extracción se deben al porcentaje de aire que es extraído o recirculado, y la manera en la cual el aire de extracción sale de la zona de trabajo.
La Tabla 2 da una explicación. El gabinete tipo A tiene un 70% de aire en recirculación constantes, mientras un 30% es extraído del gabinete por medio de un pleno común. En el tipo Bl 30% del aire es recirculado y 70% es extraído directamente fuera de la zona de trabajo a través del ducto, al exterior. Finalmente en los gabinetes B2 100% extracción no hay recirculación. Todo el aire es extraído directamente del área de trabajo fuera del gabinete.

GABINETES CLASE II - TIPO A

En los gabinetes Clase II Tipo A, tales como Sterilgard (Figura 11), 30% del aire se extrae del filtro HEPA de extracción mientras el restante 70% se recircula a través del filtro HEPA de inyección al área de trabajo. Las Figuras 12 y 14 muestran la cortina de aire inducida, la que impulsada luego por el ventilador se bifurca en aire en flujo laminar sobre la mesa de trabajo, mientras que el resto es extraído por el filtro HEPA.
La salida de patógenos es evitada en la parte del frente del equipo por la cortina de aire, la que al mismo tiempo evita la entrada de aire contaminado a la zona de trabajo. En ambos equipos el volumen total de aire es impulsado por el motoventilador al pleno. En el mismo, el aire se bifurca evacuándose un 30% a través del filtro HEPA de salida, entrando nuevamente al aire ambiente libre de partículas, o expulsado al exterior del edificio por medio de conductos. El restante 70% del aire es impulsado a través del filtro HEPA de inyección y entra al área de trabajo estérilmente en régimen laminar.
Los equipos Tipo A pueden tener la extracción del aire a través del filtro HEPA de salida al interior del laboratorio o al exterior. Esto se indica en la Figura 10 donde se ven ambos casos. El esquema de la izquierda muestra un equipo con salida al interior del laboratorio mientras que el de la derecha muestra el mismo equipo con el filtro de salida conectado a una transición que lo une al conducto hacia el exterior.

EQUIPO CLASE II - TIPO B1

Como se ha visto anteriormente, el gabinete Tipo B1 clásico, extrae el 70% del aire, recirculando solamente el 30% del mismo.
Además este gabinete incluye en su diseño tres elementos particulares, a saber:
§ 1. Todo el aire de extracción es tomado directamente de la zona de trabajo y llevado por medio de un conducto al sistema de extracción central del edificio al exterior, mediante un ventilador centrífugo situado en el techo.
§ 2. El 30% del aire recirculado es filtrado a través de un filtro HEPA inmediatamente debajo de la superficie de trabajo antes de ser recirculado.
§ 3. Todo el aire no filtrado fluye al gabinete bajo presión negativa. Todas las áreas de presión positiva están libres de partículas debido a la ubicación del filtro de inyección.
Aclara la descripción anterior el diagrama que se muestra en la Figura 12, la que
ilustra un corte de un gabinete Tipo B1.

EQUIPO CLASE II - TIPO B2

El segundo tipo de los gabinetes Clase II tipo B es de 100% de extracción total, como se ve en la Figura 13.
Este tipo de gabinete es ampliamente utilizado en toxicología y en aplicaciones similares, en las cuales efluentes con productos químicos en fase gaseosa se encuentran presentes, pero el aire debe mantenerse en condiciones extremas de limpieza en cuanto a partículas.
Como su nombre lo indica el 100% del caudal de aire que pasa a través del gabinete va al exterior o donde el aire no origine riesgos. No hay recirculación del aire dentro del gabinete.
El diagrama de la Figura 16 muestra una vista del gabinete mencionado. El aire entra a través de un motoventilador en el gabinete y pasa a través de un filtro HEPA al área de trabajo en régimen laminar vertical. El aire desciende hasta la mesa de trabajo de donde sale a un sistema separado de extracción para el tratamiento apropiado. Simultáneamente el aire que entra al gabinete por la reja perforada del frente es inmediatamente llevando al sistema de extracción.

GABINETES CLASE II - TIPO B3

Son gabinetes que, como se indicó en la Tabla 2, tienen un 70% de aire en recirculación y 30% de extracción, razón por la cual no son aptos para trabajos con generación de vapores o gases. Su construcción es prácticamente igual a los equipos Clase II Tipo A. su única diferencia con ellos es que mientras los equipos tipo A pueden ser con extracción al interior del laboratorio, los Clase II Tipo B3 son únicamente aplicados para tener la salida al exterior del edificio tal como se ilustra en la Figura 14.

USO DE LOS GABINETES DE SEGURIDAD BIOLOGICA CLASE II

Recordamos que los gabinetes de seguridad biológica Clase II se diseñaron para evitar el escape de patógenos de la zona de trabajo al ambiente del operador, así como para mantener el material y los cultivos libres de la contaminación ambiental. Estos equipos son un elemento importantísimo en la mayoría de los experimentos con material biológico.
La salida de patógenos al exterior de la mesa de trabajo es evitada por la cortina de aire que circula por la abertura frontal hacia la reja perforada perimetral de la mesada y por la acción del filtro HEPA de extracción.
La cantidad de aire que entra por la reja de entrada es igual a la cantidad de aire extraída a través del filtro HEPA de salida.
La contaminación del área de trabajo, por otro lado, es evitada por la acción del flujo laminar originado en el filtro de inyección.
El aire fluye en régimen laminar hacia la mesa de trabajo y, amén de producir un área limpia, barre los contaminantes generados por la actividad dentro del gabinete (Figura 16)
El aire continúa su recirculación por el ventilador hacia el pleno. Los aerosoles se eliminan por los filtros HEPA a medida que el aire retorna hacia la zona de trabajo.
Para utilizar adecuadamente este equipamiento es fundamental el manejo óptimo de los materiales, y minimizar la actividad por una estudiada secuencia de operaciones, procurando eliminar todo movimiento innecesario, para bajar a un mínimo las turbulencias y generación de aerosoles.

CERTIFICACION

El primer paso al instalarse un equipo de Seguridad Biológica Clase II, consiste en certificarlo, ya sea en cuanto a la integridad del gabinete y su estanqueidad, así como en el ensayo de integridad y la eventual reparación en caso de que hubiera pérdidas de los filtros HEPA, como lo demuestran las Figuras 15 y 18. Además debe medirse la uniformidad de flujo de aire (Figura 16)

PREPARACION DE PROCEDIMIENTOS

Idealmente deberá hacerse una lista de procedimientos a seguir con una adecuada hoja de ruta, anticipándose los movimientos de materiales, equipos y procesos hasta cumplir con la tarea asignada (Figura 19).
Una vez completada la lista de trabajos se comienza la operación prendiéndose las luces, poniendo en marcha el ventilador, chequeando que las rejas perforadas estén sin obstrucciones y permitiendo el funcionamiento del equipo por unos 15 minutos.
Algunos gabinetes están equipados con lámparas ultravioletas que deben apagarse cuando el personal del laboratorio está ocupando el mismo. La acción bactericida de las lámparas ultravioletas se efectúa cuando el gabinete está fuera de operación, aunque se considera de la mayor importancia la desinfección de las superficies interiores del mismo por lavado de éstas con una solución de alcohol al 70%.
Los operadores deberán lavarse cuidadosamente manos y brazos, antes y después del trabajo en el gabinete.
Se recomienda además que los operadores utilicen guantes de goma con los puños del delantal de magas largas, ceñido a las muñecas. No se aconseja el uso de delantales de algodón, sino los de fibra sintética. Lo antedicho baja a un mínimo el peligro de que la flora de la piel contamine el área de trabajo y protege manos y brazos de la contaminación de agentes peligrosos.
Resumiendo los procedimientos de preparación de los gabinetes de seguridad
biológica, tendremos que considerar:

§ 1. Certificación de integridad de los filtros HEPA, balance de la cortina de aire, verificación de la velocidad de desplazamiento del aire y certificación de estanqueidad del gabinete (Figura 18).
§ 2. La preparación de los procedimientos y la hoja de ruta para minimizar los movimientos son fundamentales para una buena disposición de los materiales y productos a ser usados en la experiencia (Figura 19).
§ 3. El procedimiento de puesta en marcha consiste en prender las luces, verificar que las rejas de aire de entrada y extracción no estén obstruidas y la puesta en marcha del ventilador. Deberá permitirse operar al ventilador por un mínimo de 5 minutos antes de dar comienzo a las operaciones dentro del gabinete.
§ 4. Una vez colocados materiales y productos dentro del gabinete sin que ninguno de estos obstruya el paso de aire generando turbulencias sobre los elementos críticos, y disponiéndolos de manera tal que las operaciones planeadas previamente se puedan hacer con comodidad, se dejará el gabinete en funcionamiento por alrededor de 5 minutos para permitir la eliminación de aerosoles que pudieran encontrarse dentro del mismo.
§ 5. Es importante que se disminuyan a un mínimo los movimientos del personal y equipos en la cercanía del gabinete, así como la posibilidad de corrientes de aire provocadas por las puertas y ventanas abiertas. Es recomendable que tanto los equipos Clase II como los equipos de Flujo Laminar común estén dispuestos en zonas del laboratorio lo más alejadas posibles de las puertas de acceso y del movimiento del personal.
§ 6. Todo movimiento es nocivo tanto dentro del gabinete como para la cortina de aire del mismo, por lo que tanto se insiste en el planeamiento adecuado para evitar movimientos innecesarios.
Cada vez que brazos o manos se introducen con material al gabinete existe peligro de escape o entrada de aerosoles, lo que se evita con movimientos muy lentos y pausados del operador (Figura 20).
La figura 23 muestra claramente la operación de un equipo Clase II.
La norma de la National Sanitation Foundation N.S.F. 49 especifica velocidades de la cortina de aire de 0.38 m/seg. (75 pies min.) para los equipos B1, B2, B3. Asimismo se recomienda una altura de la apertura por donde se introducen las manos de no más de 20 cm (8").
§ 7. Finalmente en la Figura 22 se ve una fotografía tomada en los laboratorios de microbiología de The Baker Co., donde se certifica la eficiencia de la cortina de aire de un equipo Clase II. Para ello un tubo de acero introducido en el gabinete simula la acción de un brazo del operador, mientras dos tomadores de muestras biológicas ubicados en el exterior, verifican que no haya salida de aerosoles generados en el interior del gabinete. Al mismo tiempo, placas de Petri ubicadas en el interior, verifican la falta de penetración de aerosoles portadores de microorganismos provenientes del exterior.

GABINETES DE ALTA SEGURIDAD CLASE III

Los gabinetes Clase III, originariamente llamados "cajas de guantes" por sus características constructivas, son gabinetes herméticos en los que el trabajo se efectúa por medio de guantes. Tienen filtros HEPA de inyección y de extracción en régimen turbulento (Figura 23).
El ambiente interior del gabinete se encuentra con una presión negativa con respecto al ambiente exterior de 12.5 mm de columna de agua, para prevenir el escape de aerosoles en caso de que hubiera una fisura accidental.
Se utilizan típicamente para trabajos con cultivos de agentes patógenos de alto riesgo o con virus exóticos, entre ellos: Fiebres Hemorrágicas, Lasa, Ebula y Agentes Infecciosos clasificados como clase 4 por el CDC (Center for Disease Control, Office of Biosafety).
Los gabinetes Clase III proveen una barrera física total entre ambientes y operador (Figura 24).
Se utilizan actualmente no sólo en la prevención de la contaminación del operador y del ambiente, sino también como aisladores para llenado aséptico de productos farmacéuticos.
En este último caso, tratándose de llenado estéril de productos farmacéuticos la presión interior es negativa o positiva dependiendo de si debe mantenerse al ambiente de producción libre de polvo que se procesa o si se aísla una llenadora de líquidos inyectables.
La manipulación de los elementos en el interior del gabinete se hace por medio de guantes, lo que hace imposible la contaminación por contacto.
Los sistemas Clase III son imprescindibles en el control de contaminantes de alto riesgo y los generados por manipuleo, pesaje y dilución de carcinógenos químicos. También es necesaria su aplicación cuando se trabaja con altas concentraciones de agentes de riesgo moderado o riesgo desconocido.
Los sistemas Clase III cumplen con la máxima seguridad, el doble compromiso de salvaguardar el producto del contaminante exterior, y al exterior del producto, evitándose la contaminación del ambiente de laboratorio y del personal. Una fotografía de un sistema complejo de alta seguridad (Clase III) se ilustra en la Figura 28.
Un sistema de Clase III puede ser construido para aislar incubadoras, congeladoras centrífugas y otros materiales de investigación.
Autoclaves de doble puerta se conectan a los sistemas para la esterilización de productos, tanto al introducirse o al extraerse del sistema.
Debe ponerse especial cuidado en el control periódico de la integridad de los filtros HEPA y su eventual sellado, así como el control de la hermeticidad de los gabinetes (Figura 26 y 27). Es práctica común la utilización en la extracción de dos filtros HEPA en serie, uno en el gabinete y otro en el conducto de extracción.
Como se mencionó anteriormente, los equipos Clase III se están usando en la industria farmacéutica para la aislación de procesos de fraccionamiento o envasado
estéril. En otras palabras, se los utiliza con el nombre de "Isolators" (aisladores) en procesos de producción aséptica.
La Figura 28 muestra una línea de llenado aséptico de líquidos inyectables estériles. Aunque el trabajo por medio de guantes es relativamente incómodo, la mayor ventaja de estos equipos es que se hace prácticamente imposible la contaminación por contacto.
Por otro lado, no habiendo introducción de posibles contaminantes, la circulación del aire por filtros HEPA en régimen no laminar es suficiente, manteniéndose la presión positiva en este caso.
La Figura 29 muestra un aislador usado en el fraccionamiento de una droga inyectable utilizada en quimioterapia. En este caso, la presión es negativa dentro del gabinete para proteger al personal y al medio ambiente del producto. Tiene agregado un túnel de entrada de viales bajo radiación UV y valida por abertura de los viales ya llenados y cerrados.